基因擴增PCR的擴增與克隆方法及一些使用的小建議

　基因擴增PCR主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要外，還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行，擴增反應混合液應使用分子生物學級的，試劑制備好后應有質檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。

　　基因擴增PCR的擴增與克隆方法：

　　①引物的序列應位于基因組DNA的高度保守區，且與非擴增區無同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結合，提高反應的特異性

　　②引物長度：15－40bp為宜。引物過短或過長均可使反應的特異性下降。

　　③引物的堿基盡可能隨機發布，避免出現數個嘌呤或嘧啶的連續排列，G+C堿基的含量在40%－75%之間。

　　④引物內部應避免形成二級結構，特別是引物的末端應避免有回文結構。

　　⑤二個引物不應有互補序列，特別是3’端應避免互補，以免形成“引物二聚體”，浪費引物。

　　⑥引物5’末端堿基無嚴格限制，在與模板DNA結合的引物長度足夠的條件下，其5’端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態，因此可在引物5’端加上限制性內切酶位點、啟動子序列或其它序列等以便于PCR產物的分析克隆等，引物的5’端至多可加10個堿基而對PCR反應無影響。

　　基因擴增PCR的使用建議：

　　1、使用本制品時務必將Buffer反復混勻后再加，避免因組分不一導致結果差異；

　　2、配置和分裝反應液時請一定使用新的（無污染的）噴頭以避免污染；

　　3、如擴增條帶多，可適當添加酶和dNTPs；

　　4、當多重PCR擴增產物的長度均在1kb以內時，使用3%～4％濃度的Agarosegel進行電泳分離效果。